1958- Matthew Meselson e Franklin Stahl: l’esperimento della replicazione

Dimostrarono che il DNA replicato si ottiene copiando quello vecchio.
Ogni volta che la cellula si divide si deve formare nuovo DNA- ciascuna cellula figlia deve ricevere una fedele copia del DNA cellulare parentale. Watson e Crick suggerirono che durante la replicazione si separano i due filamenti di DNA e ciascun filamento funge da stampo per la sintesi di un nuovo filamento a lui complementare. Questo meccanismo è chiamato “replicazione semi-conservativa” perché ciascuna delle molecole figlie ha un filamento vecchio ed uno nuovo. Nel 1958 Matthew Meselson e Franklin Stahl pubblicarono i risultati che confermavano questo modello. Il nostro esperimento ha fatto uso di isotopi dell’azoto e della centrifugazione su gradiente di densità. Iniziarono facendo crescere Escherichia coli in una coltura contenente 15N che è un isotopo dell’atomo di azoto. Quando i batteri crescevano e si dividevano, l’azoto 15N veniva incorporato in ciascuna base di DNA (le basi si chiamano per l’appunto “azotate”) A,C,G e T. Prelevarono quindi un campione dai batteri marcati con 15N per analisi successive. Il resto della coltura venne trasferito in un terreno di coltura fresco contenente azoto normale-14N- che è più leggero del suo isotopo 15N. In questo modo era reso disponibile solo azoto normale per le successive costruzioni di nuovo DNA durante le replicazioni batteriche. Venne poi sempre addizionato azoto normale ogni volta che la popolazione batterica raddoppiava. Per controllo prepararono una terza coltura di batteri cresciuta sempre e solo in azoto normale. A questo punto esaminarono la composizione azotata del DNA batterico in ciascuna coltura. Per far questo isolarono il DNA dalle colture batteriche e lo dissolsero in una soluzione fortemente salina. Centrifugarono quindi il DNA ad alta velocità La forza centrifuga spinge verso fondo della provetta le molecole del sale lasciando sempre meno molecole man mano che si va verso la cima della provetta. Quanto maggiore è il numero delle molecole di sale, tanto maggiore è la densità della soluzione. Meselson e Stahl si aspettavano che le molecole composte dal pesante 15N andassero più in fondo nel gradiente di sale rispetto alle più leggere molecole di 14N. E questo fu esattamente quello che videro nelle provette prelevati dalle colture di 15N e 14N. Le provette critiche erano quelle contenenti campioni delle colture prima cresciute in 15N e poi con 14N. Nel campione 2, preso dopo che la popolazione batterica (e le sue molecole di DNA) si era raddoppiata, la banda di DNA che osservarono era esattamente a metà tra le bande del 14N e del 15N. Nel campione 3, prelevato subito dopo, c’erano due bande di DNA. Una coincideva esattamente in altezza con la banda 14N, mentre l’altra era nel punto di mezzo. Questi risultati sono coerenti con il meccanismo predetto di replicazione semiconservativa. Le molecole di DNA pesante erano nel campione 1 dove entrambi i filamenti hanno incorporato il pesante 15N. Vennero trovate molecole leggere di DNA nel campione 4 che conteneva solo 14N perché i batteri erano cresciuti in 14N. Nel campione 2, le molecole di DNA si radunano in una banda di densità intermedia. Quando alla coltura batterica è stato cambiato 15N con 14N, ogni nuova molecola di DNA deve aver usato 14N. I due filamenti con pesante 15N del DNA parentale, si sono separati e hanno agito da stampo per l’incorporazione di 14N nei nuovi filamenti di DNA. Così, tutto il DNA è un ibrido con un filamento pesante ed uno leggero. Il campione 3, sottoposto un ulteriore ciclo di replicazione, contiene due bande separate nella provetta centrifugata. In questo caso, ciascuna molecola ibrida si separa in un filamento leggero ed uno pesante.Il filamento parentale pesante ha fatto da stampo per fare un filamento leggero complementare che porta ad un’altra molecola ibrida. Anche il filamento leggero parentale fa da stampo per incorporare nucleotidi leggeri, ma questa volta si forma una molecola con entrambi i filamenti leggeri. Il DNA a densità intermedia e il DNA tutto leggero si separano come due bande separate nella provetta. Meselson e Stahl non conoscevano i dettagli della replicazione al momento in cui pubblicarono i loro risultati. Ora, era chiaro che le predizioni di Watson e Crick sulla replicazione semiconservativa erano corrette Questo esperimento è stato definito l’esperimento più elegante della biologia molecolare.